Registro completo de metadatos
| Campo DC | Valor | Lengua/Idioma |
|---|---|---|
| dc.provenance | Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA | - |
| dc.contributor | Moreno de Colonna, Silvia M. | - |
| dc.contributor | Zaremberg, Vanina | - |
| dc.creator | Zaremberg, Vanina | - |
| dc.date.accessioned | 2018-05-04T22:03:13Z | - |
| dc.date.accessioned | 2018-05-28T16:35:49Z | - |
| dc.date.available | 2018-05-04T22:03:13Z | - |
| dc.date.available | 2018-05-28T16:35:49Z | - |
| dc.date.issued | 1999 | - |
| dc.identifier.uri | http://10.0.0.11:8080/jspui/handle/bnmm/73622 | - |
| dc.description | El objetivo general de esta tesis es contribuir al estudio del mecanismo de activación de las proteinas quinasas dependientes de cAMP (PK A). Algunos de los grandes problemas a dilucidar en este tema son: si la enzima necesita disociarse en sus subunidades catalltica y regulatoria para activarse por cAMP , si el cAMP es el único agente necesario para la activación de la enzima y cómo se adquiere la selectividad de sustratos. Para este trabajo se han utilizado como modelos dos eucariontes inferiores. 1) PKA parcialmente purificada del hongo dimórflco Mucor rouxii, y ensayos in vitro. 2) Mutantes de subunidad regulatoria (bcy1) de la PKA de la levadura Saccharomyces cerevisiae con un abordaje genético-bioquímico-molecular. Utilizando el primer modelo y trabajando a concentraciones de holoenzima del orden de nM hemos llegado a las siguientes conclusiones (Mechanism of activation of cAMP-dependent protein kinase. In Mucor rouxii the apparont specific activity of the CAMP activated holoenzyme is different to that of its free catalytic subunit”. V.Zaremberg, A.Donnella-Deana and S.Moreno. Enviado a Archives in Biochemistry and Biophysics). - en este rango de concentración la actividad enzimática utilizando péptidos sintéticos como sustratos no es lineal con la concentración de enzima. Con la proteina protamina, utilizada como referencia, la actividad es casi lineal en el mismo rango de concentración. - la dependencia de la actividad fosforilante de cada péptido, con el cAMP, el grado de inhibición por un péptido inhibidor especifico y la modulación por policationes dependen del péptido utilizado. - en todos los ensayos arriba mencionados la relación de las actividades fosforilantes de la enzima con los distintos péptidos, comparados entre si o con la protamina, es diferente a la misma relación estimada a partir de las actividades medidas con la subunidad catalitica libre. Estos resultados se explican con dos modelos posibles: a) la subunidad catalitica libre es la entidad que fosforila los sustratos y el nivel de producción de subunidad C depende del cAMP y del sustrato; b) a altas concentraciones de holoenzima, existe holoenzima sin disociar con cAMP unido; esta especie es cataliticamente activa y la selectividad de esta especie por los sustratos es diferente a la de la subunidad catalitica libre. En el segundo modelo se han utilizado mutantes espontáneas, cedidas por el Dr. Kelly Tatchell, en el gen que codifica para la subunidad regulatoria (bcy1) de la PKA. En un primer trabajo (Analysis of the mechanism of activation of cAMPdependent protein kinase through the study of mutants of the yeast regulatory subunit. ” V.Zaremberg and S.Moreno, Eur.J.Biochem. 237: 136-142, 1996) trabajando con las cepas mutantes se obtuvieron los siguientes resultados: - los niveles de las subunidades regulatoria ( R) y catalltica (C ) en las cepas mutadas son similares a los de la cepa salvaje. - Una medida aproximada de la afinidad de las subunidades R mutadas por el CAMP, indicó que se encuentra disminuida. - Midiendoactividad de PKA en células penneadas en ausencia y presencia de cAMP, se encontró que las mutantes demuestran actividad dependiente de cAMP,aunque tienen una actividad basal elevada. - Los fenotipos se hicieron más severos si el fondo genético de las levaduras era RAS2; y permanecieron iguales por sobreexpresión del gen para PDE2. En la tercera parte de la tesis, y utilizando el mismo modelo de S.cerevisiae se encaró la sobreexpresión de algunas de las mutantes bcy1: construcción de los vectores correspondientes, estudio de la sobreexpresión y análisis de los fenotipos resultantes. El conjunto de estos resultados (manuscrito en preparación) confirma la conclusión que obtuviéramos en la primera parte: las holoenzimas mutadas tienen actividad enzimática. Del conjunto de los resultados genético-bioquímicos obtenidos hasta ahora en el sistema de las mutantes de levadura hemos concluido, que las holoenzimas mutadas tienen actividad fosforilante de proteinas sin necesidad de disociarse en sus subunidades, que la capacidad fosforilante de proteinas es diferente para cada mutante (diferentes fenotipos) y proponemos que los cambios conformacionales producidos por las mutaciones pueden ser similares a los introducidos por el cAMP al interactuar con la holoenzima. | - |
| dc.description | The general aim of this thesis is to contribute to the study of the mechanism of activation of CAMP-dependent protein kinases (PKA). Some of the questions to solve on this field are the following: is it necessary for the holoenzyme to dissociate to be activated by CAMP? ls cAMP the only agent that promotes activation? How do the holoenzymes select the substrate to phosphorylate? In this work we have used two lower eukaryotic models. 1) Partially purified PKA from the dimorphic fungus Mucor rouxii and in vitro assays. 2) Mutants of the regulatory subunit (bcy1) of protein kinase A from the yeast Saccharomyces cerevisiae , using a molecular-genetic-biochemical approach. Using the first model and working at holoenzyme concentrations in the range of nM we have arrived to the following conclusions (Mechanism of activation of cAMP dependent protein kinase. In Mucor muxii the apparent specific activity of the cAMP activated holoenzyme is different to that of its free catalytic subunit, V.Zaremberg, A.Donnella-Deana and S.Moreno; submitted to Archives in Biochemistry and Biophysics) - under this range of enzyme concentration, the enzymatic activity using peptide as substrates is non linear; while it is almost linear when using protamine as substrate. - the dependency of each peptide phosphorylating activity with cAMP, the degree of inhibition by a specific peptide inhibitor, and the activation by polycations depends on the peptide used as substrate. - in all the above mentioned assays. the relationship of the apparent specific activity of the holoenzyme with each peptide , is different from the one displayed by the isolated free catalytic subunit. These results can be explained by two posible models: a) the free catalytic subunit is the enzymatic species that phosphorylates the substrates and the level of production of free C depends on cAMP and on the protein or peptide substrate; b) at high holoenzyme concentration, the existance of the species cAMP-bound holoenzyme is posible; this species is catalytically active and the selectivity for the substrates of this species is different from the one of the free catalytic subunit. In the second model we have used spontaneous mutants on the bcy1 gene, isolated and generously provided by Dr. Kelly Tatchell. In first stage of this approach we have obtained the following results: (Analysis of the mechanism of activation of CAMP-dependent protein kinase through the study of mutants of the yeast regulatory subunit, V.Zaremberg and S. Morenoi, Eur.J.Biochem. 237: 136-142, 1996.) - the levels of the regulatory (R) and catalytic (C) subunits of PKA in the mutated strains is similar to the levels of the wild type strain. an approximate measurement of the affinity of the mutated R subunits for cAMP indicates that the affinity is decreased. measurement of PKA activity in the abscence and presence of CAMP in permeabilized mutated and wild type cells indicates that the holoenzymes are dependent on CAMP and that basal activity is high. - the phenotypes were more severe when working on a wild type RAS2 background; and were maintained alike when over expression the gene for PDE2 (CAMP phosphodiesterase). In the third part of this thesis, and using the same model of S.cerevisiae mutant strains, we began the over expression of some of the bcy1 mutants: vector construction, analysis of the over expression and analysis of the derived phenotypes. These results suggest that the mutated holoenzymes are active. From the results obtained from the molecular genetic approaches, taken as a whole, we conclude that the mutated holoenzymes have catalytic phosphorylating activity without dissociating into its subunits; that the selectivity of substrate phosphorylation for each mutated holoenzyme ¡s different (different phenotypes) and we propose that the conformational structural changes produced by the mutatioon can be similar to the changes promoted by cAMP upon interaction with the holoenzyme. | - |
| dc.description | Fil:Zaremberg, Vanina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. | - |
| dc.format | application/pdf | - |
| dc.language | spa | - |
| dc.publisher | Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires | - |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | - |
| dc.rights | http://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar | - |
| dc.source.uri | http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3220_Zaremberg | - |
| dc.title | Estudio del mecanismo de activación de la quinasa de proteínas dependiente de cAMP | - |
| dc.title | Study of the mechanism of activation of cAMP dependent protein kinase | - |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | - |
| dc.type | info:ar-repo/semantics/tesis doctoral | - |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion | - |
| Aparece en las colecciones: | FCEN - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA | |
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