Registro completo de metadatos
| Campo DC | Valor | Lengua/Idioma |
|---|---|---|
| dc.provenance | Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA | - |
| dc.contributor | Ermácora, Mario R. | - |
| dc.contributor | Santos, Javier | - |
| dc.creator | Santos, Javier | - |
| dc.date.accessioned | 2018-05-04T21:53:49Z | - |
| dc.date.accessioned | 2018-05-28T16:39:45Z | - |
| dc.date.available | 2018-05-04T21:53:49Z | - |
| dc.date.available | 2018-05-28T16:39:45Z | - |
| dc.date.issued | 2004 | - |
| dc.identifier.uri | http://10.0.0.11:8080/jspui/handle/bnmm/74115 | - |
| dc.description | Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de su estructura tridimensonal (3D). Hoy sabemos que el plegado proteico permite la conversión de la información existente en la secuencia de aminoácidos en información 3D, pero no sabemos cómo se lleva adelante este proceso. Tampoco se conoce la lógica con que se distribuye la información 3D en la secuencia y no existe una opinion unificada sobre el grado de estructura presente en los estados parcialmente plegados ni sobre el papel de estos últimos en el plegado proteico. Sí existen algunas pruebas de que la información conformacional no estaria distribuida homogéneamente en la secuencia proteica. En una misma cadena polipeptídica existen fragmentos o bloques que pueden ser eliminados sin producir alteraciones en el plegado final, por lo que no formarían parte del conjunto de residuos determinantes de la estructura 3D nativa. Por el contrario, otros fragmentos aparentemente no pueden ser removidos sin abortar el proceso de plegado. En este trabajo de tesis se utilizó a la β-lactamasa de Bacillus Licheniformis. ES-βL como modelo experimental para estudiar el proceso de conversión de información 1D → 3D e investigar la existencia de módulos de información para el plegado. Se eligió a ES-βL como modelo principalmente porque a) la existencia de proteína correctamente plegada (nativa) es fácilmente detectable por actividad enzimática. aún en trazas; b) se conoce su estructura cristalográfica con gran resolución; c) no posee puentes disulfuro que compliquen adicionalmente el plegado; y d) ES-βL no es un modelo excesivamente reduccionista: posee dos dominios y una topología medianamente intrincada. Para caracterizar el modelo experimental se estudiaron aspectos generales de la estructura, el plegado, y estados intermediarios de ES-βL, tanto desde un punto de vista cinético como en el equilibrio. La estructura de formas parcialmente plegadas también se estudió a partir de experimentos de modificación química de cisteínas introducidas a tal fin en la cadena polipeptídica como sondas conformacionales. El desplegado de ES-βL inducido por urea presentó más complejidad que el desplegado por GdmCl. En el primer caso, se detectaron por lo menos cuatro estados parcialmente plegados. Inesperadamente, el reemplazo de Ser265 → Cys265 tuvo consecuencias importantes para el plegado. El efecto desestabilizador de la mutación sobre los estados parcialmente plegados indicó que el residuo formaría parte de un módulo estructurado en dichos estados. La observación de estados parcialmente plegados, curvas de desnaturalización no coincidentes, transiciones multifásicas, cores resistentes e intermediarios cinéticos es compatible con un mecanismo de ensamblado modular o plegado por partes de la β-lactamasa. Por otra parte, en este trabajo se manipuló la secuencia de la proteína para estudiar la interdependencia de los niveles jerárquicos de estructura en el proceso de plegado. Se evaluó el contenido de información para el plegado de ES-βL codificado por la hélice α C-terminal. Para estudiar el papel de esta hélice se prepararon y caracterizaron tres variantes de ES-βL acertadas, en nueve, catorce y diecinueve residuos desde el C-terminal. ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 y ES-βLͨΔ19, respectivamente. Los lisados de bacterias expresando ES-βLͨΔ19 no presentaron actividad β-lactamasa. Por el contrario, dicha actividad sí fue detectada en lisados conteniendo tanto ES-βLͨΔ9 como ES-βLͨΔ14, demostrando de manera preliminar que una fracción de estas moléculas, puede adquirir estructura nativa. La caracterización rigurosa de ES-βLͨΔ9 permitió demostrar que la secuencia de residuos eliminada tiene un rol en el mecanismo de plegado pero que su ausencia no impide la formación de estructura 3D nativa. También se caracterizó en detalle Ip ES-βLͨΔ9, un estado parcialmente plegado, que está conectado con la forma nativa de ES-βLͨΔ9. Ip ES-βLͨΔ9 sólo posee estructura secundaria residual, pero es muy compacto. Posee las características de un glóbulo fundido y puede esmbilizarse formando un dímero. La eliminación de los residuos 287-295 afecta dramáticamente la velocidad de replegado de la β-lactamasa: ES-βLͨΔ9 se pliega 10 4 veces más lentamente que ES-βL. A partir del estudio tennodinámico y cinético de ES-βLͨΔ9 se concluyó que los residuos eliminados proveen información para formar estructura secundaria, evitar trampas cinéticas y asociación errónea de unidades de plegado, acelerar el pasaje a través del estado de transición y estabilizar al estado nativo. Los resultados obtenidos con la β-lactamasa se compararon con otros datos de literatura referidos a proteínas que a pesar de carecer de partes de su secuencia alcanzan un plegado nativo. El conjunto de las evidencias experimentales parece sugerir que la cadena polipeptídica tiende a plegarse guiada principalmente por información local en la secuencia. Las interacciones entre residuos alejados secuencialmente jugarían un papel secundario en el proceso de plegado y aparecerían posteriormente, luego de que la cadena polipeptídica adopte el recorrido espacial apropiado. | - |
| dc.description | The biological properties of proteins rest upon their specific native three-dimensional structure. and it is known that protein native structure is the result of a folding process by which sequential information is spontaneously converted into three-dimensional information. However, it is unknown how the three-dimensional information is encoded by the sequence. Moreover, although the native, biologically active, conformation can be characterized in atomic detail, a clear understanding of the structure of unfolded and partially folded states is also lacking. There are evidences suggesting that the information content is not homogenously distributed in the protein sequence: there exist particular fragments or blocks of sequence that can be eliminated without producing major alterations in the native structure, whereas other fragments, or even single residues, cannot be removed without impeding the folding process. In this work, β-lactamase of Bacillus licheniformis (ES-βL) was used as an experimental model to study the conversion of sequential information into three-dimensional information, and to investigate the existence of information modules embedded in the polypeptide chain. ES-βL was chosen as a protein folding model because: a) even traces of its native state can be detected by measuring enzymatic activity; b) its crystal structure is known with high resolution; c) it does not have disulfide bridges that would additionally complicate the folding reaction; d) it is representative of medium-size proteins with two domains and a moderately intricate topology. In the first part of the work, to characterize the experimental model, native and intermediary states of ES-βL, were studied by kinetics, equilibrium unfolding experiments, and chemical modification of Ser → Cys mutants. At least four partially folded states with different spectroscopic properties or thiol accessibility were detected in ES-βL equilibrium unfolding. Unexpectedly, it was found that a Ser265 → Cys265 replacement destabilized selectively ES-βL partially folded intermediates indicating Ser265 is establishing fixed interactions in these states. In addition the results showed the presence of partially folded states, no coincident curves when unfolding was monitored by different probes, multiphase transitions, protease resistant cores, and kinetic intermediaries. All these features suggest a modular assembling mechanism for β-lactamase. In the second part of the work, the sequence of β-lactamase was manipulated to study the interdependence of the hierarchic levels of structure (modules, independent units, topomer, native structure, etc.) in the folding process. Sequential information was eliminated with the expectation of stopping folding at different levels of structural complexity. In particular, the information content encoded by the C-terminal helix of ES-βL was evaluated. Three variants shortened by nine, fourteen and nineteen residues from the C-terminal were prepared and characterized (ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 and ES-βLͨΔ19, respectively). For ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14, most of the protein was was found forming inclusion bodies (insoluble aggregates) in transformed E. coli cells. Neither lysates of untransformed E. coli cells nor cells expressing ES-βLͨΔ19 had detectable lactamase activity. Contrastingly, lysates containing ES-βLͨΔ9 or ES-βLͨΔ14 exhibited enxymatic activity, which demonstrated that a fraction of these proteins acquired a properly folded structure in vivo. A thorough characterization of ES-βLCͨΔ19(hydrodynamics, spectroscopic and thermodynamic properties, enzymatic activity and resistance to proteolysis) allowed demonstrating that the eliminated sequence does have a role in the folding mechanism, but its absence does not prevent the acquisition of native structure. Also Ip ES-βLͨΔ9, a partially folded state, was discovered and characterized. Ip ES-βLͨΔ9 lacks tertiary structure, but it is compact and possesses residual secondary structure. These features are typical of molten globules, but this one is unusual because it forms a dímer in a concentration dependent process. ES-βLͨΔ9 folds 10 4 times more slowly than ES-βL. From a thorough thermodynamic and kinetic study of ES-βLͨΔ9, it is concluded that the eliminated residues (287-295) participate in folding at different levels: (a) encoding secondary structure; (b) encoding tertiary structure indirectly, avoiding kinetic traps and erroneous association of folding units; (c) participating in the folding transition state; (d) stabilizing the native state. Finally, in this thesis work it is discussed available experimental information on native proteins lacking parts of their sequences, and the relevance of these results to protein folding. | - |
| dc.description | Fil:Santos, Javier. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. | - |
| dc.format | application/pdf | - |
| dc.language | spa | - |
| dc.publisher | Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires | - |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | - |
| dc.rights | http://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar | - |
| dc.source.uri | http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3745_Santos | - |
| dc.subject | FOLDING | - |
| dc.subject | PROTEIN | - |
| dc.subject | TRUNCATED | - |
| dc.subject | INFORMATION | - |
| dc.subject | PARTIALLY FOLDED STATE | - |
| dc.subject | ß-LACTAMASE | - |
| dc.subject | FRAGMENT | - |
| dc.subject | PLEGADO | - |
| dc.subject | PROTEINA | - |
| dc.subject | FRAGMENTO | - |
| dc.subject | INFORMACION | - |
| dc.subject | ESTADOS PARCIALMENTE PLEGADOS | - |
| dc.subject | ß-LACTAMASA | - |
| dc.title | Estudio del plegado proteico: la ß-lactamasa | - |
| dc.title | Protein folding study : ß-lactamase | - |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | - |
| dc.type | info:ar-repo/semantics/tesis doctoral | - |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion | - |
| Aparece en las colecciones: | FCEN - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA | |
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