1. RODNA
  2. FCEN
  3. FCEN - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA
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Campo DC Valor Lengua/Idioma
dc.provenanceFacultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA-
dc.contributorSanta Coloma, Tomás A.-
dc.contributorTaminelli, Guillermo Luis-
dc.creatorTaminelli, Guillermo Luis-
dc.date.accessioned2018-05-04T22:01:18Z-
dc.date.accessioned2018-05-28T16:47:41Z-
dc.date.available2018-05-04T22:01:18Z-
dc.date.available2018-05-28T16:47:41Z-
dc.date.issued2010-
dc.identifier.urihttp://10.0.0.11:8080/jspui/handle/bnmm/74457-
dc.descriptionLa Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva producida por mutaciones en el gen que codifica el canal de cloruro CFTR. Muy poco se sabe sobre los mecanismos moleculares involucrados en el daño celular producido por la falla del canal CFTR. Mediante la metodología de “Display Diferencial” o “Differential Display” (DD) observamos que la expresión del gen de origen nuclear CISD1 (CDGSH Iron Sulfur Domain 1) estaba disminuída en un modelo celular de FQ. Dado que el DD es una técnica que aporta evidencias pero es susceptible a falsos positivos y negativos, se decidió que el primer enfoque de esta Tesis fuera corroborar los resultados del DD. Para ello se utilizaron técnicas como RT-PCR semi cuantitativas y RT seguida de PCR en tiempo real para medir los niveles de expresión de CISD1 en distintos modelos celulares de FQ o con células que expresasen CFTR wt en presencia de inhibidores o activadores del CFTR. Ya que CISD1 es un gen que se encuentra en el genoma nuclear, el siguiente enfoque de esta Tesis fue determinar la localización subcelular de su producto. En este caso, se utilizó la expresión de una quimera unida a EGFP y mediante microscopía confocal pudimos demostrar que CISD1 codifica una proteína de localización mitocondrial. La localización mitocondrial fue confirmada por Wiley y col. Ellos además reportaron que CISD1 posee un grupo prostético del tipo 2Fe-2S en lugar de Zinc, como postulamos en un principio debido a su estructura primaria. La función de esta proteína es desconocida, pero estudios hechos en mitocondrias aisladas de células cardíacas de un ratón nulo (-/-) para mitoNEET (CISD1 en humanos) presentaban disminuída en un 30 % la capacidad máxima de la fosforilación oxidativa medida en estado 3. Además, en un trabajo anterior de Colca y colaboradores, se reportó que la proteína Minner-1 de ratón (producto de splicing alternativo de CISD1) co-inmuno precipitó con proteínas pertenecientes al complejo l de la cadena de transporte de electrones. Luego de que comprobamos su localización mitocondrial mediante la quimera GFP-CISD1, nuestro siguiente objetivo fue determinar si la actividad del complejo I mitocondrial se encontraba afectada por la expresión diferencial de CISD1 (un efecto observado en FQ por Grabriel Valdivieso en su Tesis, aún no publicado). Para tal fin medimos la actividad in gel del CIm mediante la técnica “Blue Native-PAGE” (BN-PAGE), en mitocondrias extraídas desde diferentes modelos experimentales de células FQ transfectadas con CISD1 salvaje y células Caco-2 (no FQ) transfectadas con un variante mutada de CISD1 obtenida por mutagénesis dirigida en las cisteínas 72 y 74 que fueron reemplazadas por serinas en un plásmido de expresión para eucariotas pcDNA 3.1(-). Así, observamos que la disminución significativa de la actividad del CIm reportada por Valdivieso y col. en distintos modelos FQ era restaurada por la expresión ectópica de CISD1, mientras que la variante mutada de CISD1 moduló negativamente la actividad normal del Clm en células Caco-2 (no FQ).-
dc.descriptionCystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene encoding the CFTR chloride channel. Very little is known about the molecular mechanisms involved in the disease. Using the methodology of "Differential Display" (DD), we observed that the expression of the nuclear gene CISD1 (CDGSH Iron Sulfur Domain 1) was decreased in a cell model of CF. Since DD is a technique that might provide false positive or negative results, the results has to be validated by using other methods. Thus, the first objetive of this Thesis was to corroborate the DD results. For this purpose, we used semi-quantitative RT-PCR and RT followed by real-time PCR to measure the expression levels of CISD1 in different CF cell models. We also used non-CF cells in presence of CFTR inhibitors or activators. Since CISD1 is a gene found in the nuclear genome, the following focus of this thesis was to determine the subcellular location of the CISD1 product. We used the expression of a chimera containing CISD1 linked to EGFP and by using confocal microscopy we could show that CISD1 indeed encodes for a protein of mitochondrial localization, as the program PSORT previosuly predicted. The mitochondrial location was also confirmed by Wiley et al. They reported that CISD1 has a 2Fe-2S type prosthetic group instead of zinc as we originally thought. The function of this protein is unknown yet, but studies done in isolated mitochondria of cardiac cells from a null (-/-) mouse for mitoNEET (CISD1 in humans) had decreased by 30% the maximal capacity of oxidative phosphorylation measured in state 3. Furthermore, in a previous work, Colca et al. reported that the mouse protein Minner-1 co-immune precipitated with proteins belonging to the mCl of the electron transport chain (ETC). We also showed previously (Valdivieso et al), that the mitochondrial protein ND4, which belong to the mitocondrial complex I, was reducen in FQ. Therefore, our next goal was to determine whether mitochondrial complex I activity was affected by the differential expression of CISD1. To this end, we measured the in gel mCl activity using the "Blue Native-PAGE (BN-PAGE) technique, in mitochondria extracted from different experimental models of CF cells, transfected with CISD1 wt, and non- CF cells transfected with a mutated variant of CISD1. We observed that the significant decrease in the mCl activity reported by Valdivieso et al. in different CF models, can be partially restored by the CISD1 ectopic expression, while the mutated variant of CISD1 down modulated the normal mCl activity in non-CF Caco-2 cells.-
dc.descriptionFil:Taminelli, Guillermo Luis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.-
dc.formatapplication/pdf-
dc.languagespa-
dc.publisherFacultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires-
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess-
dc.rightshttp://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar-
dc.source.urihttp://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_4788_Taminelli-
dc.subjectCYSTIC FIBROSIS-
dc.subjectCFTR-
dc.subjectCISD1-
dc.subjectMITOCHONDRIA-
dc.subjectMITOCHONDRIAL COMPLEX I-
dc.subjectFIBROSIS QUISTICA-
dc.subjectCFTR-
dc.subjectCISD1-
dc.subjectMITOCONDRIA-
dc.subjectCOMPLEJO I MITOCONDRIAL-
dc.titleEstudio de la expresión del gen CISD1 mediada por la actividad del CFTR-
dc.titleStudy of gene expression mediated CISD1 CFTR activity-
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis-
dc.typeinfo:ar-repo/semantics/tesis doctoral-
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion-
Aparece en las colecciones: FCEN - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA

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